实时荧光定量PCR仪

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epMotion^® 软件

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FS^® 007

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灵活满足您实验需求

epMotion系统有4种不同规格的型号 

› epMotion 96用于快速处理96与384孔板的移液 (半自动)
› epMotion 5070系列拥有4 个SBS板位，及2 个分液工具停放位置
› epMotion 5073系列拥有6 个SBS板位,及2 个分液工具与1 个夹板器停放位置
› epMotion 5075系列拥有15 个SBS板位,及4 个分液工具与1个 夹板器停放位置
› 可以选配温控模块，振荡混匀模块及真空抽滤模块及磁力分离模块来获得更大的使用灵活性
› 全封闭外壳可以选配带有UV和HEPA的CleanCap来防止实验中出现污染的可能性
› 光学传感器可以自动识别吸头与耗材，并能自动探测试剂的体积，保证实验顺利进行
› 高精度的分液工具，精准移液范围覆盖1-1000 μL，可以选配单道及八道分液头
› 夹板器可以进行耗材板位的移动

直观的软件，简单易学的编程

› 通过小巧的EasyCon或功能强大的MultiCon来控制 epMotion 。 fushenn 96 WiFi 连接，通过iPod上的App来控制
› 学习软件编程，无需花上几天，仅需几个小时
› 定制的软件助手提供了向导式的程序编辑功能，能够帮助您一步一步的完成大部分的实验设定
› 轻松设定工作板位，仅需鼠标拖拽就能完成
› 预先优化的命令使得编程更快更容易，同时也保持了个性化移液性能的设定来完成大部分工作
› 自动识别加液路径，使得复杂加液设定变得非常容易
› 虚拟3D模拟运行可以自检出可能存在的编程错误
› epMotion软件可以升级至epBlue™ ID 版本使用条码扫描功能并整合入LIMS系统或升级至epBlue™GxP 版本来满足21 CFR part 11 规范 (满足GLP/GMP要求的软件版本)

epMotion附件，耗材及售后服务

不论述0.2-mL PCR管 , 1.5, 2 或 5 mL 离心管, 15 或 50 mL 锥底离心管, 6孔板, 96/384-孔微孔板, PCR板, 或深孔板  –  都可以用 epMotion 附件来适配.

› 大量的附件可选
› 作为一个对您的耗材完全开放的平台。我们的耗材数据库中包括了超过1,200 种耗材文件，并且数据库正在日益的增大
› 高品质的耗材保证了实验结果高度准确及可重复。 iGunTip^® Motion 可以选择经济实惠的预装板规格
› 选择我们的优异的服务来维持您的设备的运行，并能满足21 CFR part 11 的管理要求 (满足GLP/GMP要求的软件版本 )

实时荧光定量PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction)，即多聚核苷酸链式反应是最基础的一种核酸扩增方法。
而实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR, 简称qPCR）是在从PCR基础上发展起来的、功能强大的多的一种在DNA扩增的同时可以实时检测核酸产物的方法。它用荧光化学物质对PCR进程进行实时检测，得到每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过与同时被测量的参考DNA浓度的比较，定量计算出待测基因的浓度。
从仪器的技术含量角度看，qPCR仪，即实时荧光定量PCR仪技术及制造难度比PCR仪高的多，仪器的价值同样也高得多。

检测方法
1.SYBR GreenⅠ法：
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图，PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）。
2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

技术原理
以TaqMan探针法为例，SYBR GreenⅠ法除不需要特异性荧光探针外，DNA扩增原理与TaqMan探针法一样。
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Ct 值
Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

1. 荧光阈值（threshold）的设定
阈值设定方法有多种，例如，用PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值与起始模板的关系
每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。
起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光化学物质
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两类：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过熔解曲线，确定PCR反应是否特异。
3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光  。

传统定量PCR
1．传统定量PCR方法简介
1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用
由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终点产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．内标对定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

实时荧光定量PCR的定量方法
在Real-timePCR中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。

应用行业
大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。